FNP TEAM

Celem projektu jest identyfikacja i opis nowego mechanizmu regulacji aktywności proteaz, czyli enzymów odpowiedzialnych za degradację białek w komórkach oraz odpowiedź na pytanie w jaki sposób ta regulacja aktywności proteaz wpływa na syntezę DNA w komórkach bakterii.

Hipoteza badawcza zakłada, że aktywność proteaz jest regulowana poprzez oddziaływanie proteaz ze związkami zawierającymi grupy fosforanowe takimi jak np. polifosforany czy DNA. Badania wstępne wskazują, że aktywacja poprzez takie oddziaływanie zmienia specyficzność substratową proteazy i pozwala na degradację białek w zależności od warunków wzrostu. Jest to nowa koncepcja regulacji aktywności proteolitycznej. Co więcej regulacja taka ma prawdopodobnie kolosalne znaczenie w regulacji replikacji DNA podczas stresu. To nowatorska koncepcja badawcza, która może doprowadzić do opisu nowego mechanizmu kontroli replikacji DNA. W badaniach planowane jest zastosowanie interdyscyplinarnego podejścia badawczego z wykorzystaniem zaawansowanych technik, w tym analizy struktury z użyciem mikroskopii cryo-EM czy mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz rezonansu plazmonów (SPR) jako metod opartych na analizach, w czasie rzeczywistym, pojedynczych komórek oraz pojedynczych cząsteczek białek i kwasów nukleinowych

Planowane badania dotyczyć będą analizy bakteryjnej proteazy Lon zidentyfikowanej we wszystkich gatunkach bakterii. Eksperymenty będą obejmować analizę in vitro oczyszczonych cząsteczek enzymu oraz analizę in vivo w komórkach bakterii. Uzyskane informacje, w tym dane strukturalne i kinetyczne, pozwolą z jednej strony zrozumieć mechanizm regulacji aktywności proteazy Lon poprzez oddziaływanie ze związkami posiadającymi grupy fosforanowe, a z drugiej strony zrozumieć jak aktywność Lon wpływa na replikację DNA w komórkach bakterii. Informacje te mogą mieć kluczowe znaczenie dla badań nad rozwojem nowych leków i metod terapeutycznych. Umiejętność kontroli proteolizy w komórkach bakteryjnych może stać się metodą do walki z patogenami człowieka opornymi na antybiotyki. Kontrolowana aktywacja lub zahamowanie proteolizy w komórkach bakterii pozwoli na kontrolę ich wzrostu oraz uśmiercanie i w ten sposób leczenie infekcji lekoopornych.

Kierownik projektu:

prof. dr hab. Igor Konieczny

Zespół:

dr Marta Gross
dr Małgorzata Ropelewska
dr Tomasz Chamera
dr inż. Katarzyna Bury

mgr Magdalena Sroka
mgr Ewelina Wysocka

Michał Strzała
Alicja Kuźniewska
Aldona Wierzbicka
Weronika Chmura

Partnerzy:

Fernando Moreno-Herrero, National Centre of Biotechnology CNB-CSIC, Madrid, Hiszpania
Jose Maria Valpuesta , National Centre of Biotechnology CNB-CSIC, Madrid, Hiszpania
Jolanta Zakrzewska-Czerwińska, Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego, Wrocław, Polska
Jan Lowe, MRC Cambridge
Dmitri Svergun, EMBL Hamburg

Polyphosphate induces the proteolysis of ADP-bound fraction of initiator to inhibit DNA replication initiation upon stress in Escherichia coli.
Gross MH, Konieczny I. (2020) Nucleic Acids Res. ;48(10):5457-5466. doi: 10.1093/nar/ć7. [link]

Defining a novel domain that provides an essential contribution to site-specific interaction of Rep protein with DNA.
Wegrzyn K, Zabrocka E, Bury K, Tomiczek B, Wieczor M, Czub J, Uciechowska U, Moreno-Del Alamo M, Walkow U, Grochowina I, Dutkiewicz R, Bujnicki JM, Giraldo R, Konieczny I. Nucleic Acids Res. 2021 Apr 6;49(6):3394-3408. [link]

Investigation on Lon protease structure and its interaction with DNA.
(A) A schematic representation of the hexameric ring structure of the protein Lon with selected positively-charged amino acid residues (blue spheres) engaged in interaction with DNA. The hexameric ring is represented by the monomers alternately colored with wheat and pink. The N-terminal domain (1-245 aa of the full-length Lon protease) was removed for clarity. (B) Atomic force microscopy imaging of Lon hexamer. (C) Negative staining electron micrograph of Lon protease. Representative 2D class image of Lon hexamer. (D) Atomic force microscopy imaging of Lon-DNA nucleoprotein complex

Publikacje:

Wegrzyn K, Zabrocka E, Bury K, Tomiczek B, Wieczor M, Czub J, Uciechowska U, Moreno-Del Alamo M, Walkow U, Grochowina I, Dutkiewicz R, Bujnicki JM, Giraldo R, Konieczny I. (2021) Defining a novel domain that provides an essential contribution to site-specific interaction of Rep protein with DNA. Nucleic Acids Res. 6;49(6):3394-3408. doi: 10.1093/nar/gkab113. [link]

Ropelewska M, Gross MH, Konieczny I. (2020) DNA and Polyphosphate in Directed Proteolysis for DNA Replication Control. Front Microbiol.;11:585717. doi: 10.3389/fmicb.2020.585717. eCollection 2020. [link]

Gross MH, Konieczny I. (2020) Polyphosphate induces the proteolysis of ADP-bound fraction of initiator to inhibit DNA replication initiation upon stress in Escherichia coli. Nucleic Acids Res.; 48(10):5457-5466. doi: 10.1093/nar/gkaa217. [link]