Laboratorium oddziaływań biomolekularnych

Laboratorium oddziaływań biomolekularnych jest wyposażone w szereg sprzętów pozwalających na badania złożonych układów molekularnych. Osoby zainteresowane współpracą i korzystaniem z aparatury laboratorium, prosimy o kontakt.
[e-mail]

The Laboratory of Biomolecular Interactions provides access to a wide range of equipment for studying complex molecular interactions. To discuss the collaboration and equipment access, please contact us.
[e-mail]

prof. dr hab. Rafał Sądej [e-mail]

tel. +48 58 349 15 85

prof. dr hab. Rafał Sądej [e-mail]
tel. +48 58 349 15 85

Aparatura dostępna w ramach Laboratorium
oddziaływań biomolekularnych
w MWB UG i GUMed:

The following research facilities are available at the Laboratory of Biomolecular Interaction
in IFB UG & MUG:

Spektrofluorymetr FP-8500

Wysokiej jakości spektrofluorymetr FP-8500 firmy JASCO wykonuje pomiary przy długości fali 200-750 nm (wzbudzenia i emisji). Pozwala na szybki pomiar próbek o niskiej fluorescencji ze względu na ekstremalną czułość (stosunek sygnału do szumu 8.500:1 (RMS)) oraz szybkie skanowanie widm (60.000 nm/min).

Dostępne jest oprogramowanie Spectra Manager II do sterowania, zbierania i przetwarzania danych ze spektrofluorymetru. Zawiera moduły do pomiaru fluorescencji przy ustalonych długościach fali wzbudzenia i emisji oraz do wykonywania analizy ilościowej. Intensywność fluorescencji przy danej długości fali może być także mierzona w czasie.

Wybrane zastosowania:

• badanie dynamiki białka w zależności od temperatury
• pomiar anizotropii
• badanie kinetyki enzymu
• FRET (ang. Förster resonance energy transfer)

Spektrofluorymetr [broszura]

Spectrofluorometer FP-8500 

The JASCO FP-8500 is a high-performance spectrofluorometer, which measures 200 - 750 nm wavelength range (both excitation and emission). It enables rapid measurements of low fluorescence-containing samples due to its exceptional sensitivity (S/N ratio of 8,500:1 (RMS)) and high-speed scanning (60,000 nm/min).

The Spectra Manager II program controls the spectrofluorometer and analyzes the collected data. It allows for the measurements of samples’ fluorescence intensity at fixed excitation and emission wavelengths as well as for quantitative analysis. The fluorescence intensity at a fixed wavelength can be also measured in time.

Selected applications:

• study of temperature-dependent protein dynamics,
• anisotropy measurements,
• study of enzyme kinetics,
• FRET (Förster resonance energy transfer)

Spectrofluorometer [brochure]

Fermentor Solaris 

Fermentor Solaris 

Komora beztlenowa

Anaerobic chamber [brochure]
Anaerobic chamber [manual]

Anaerobic chamber

Anaerobic chamber [brochure]
Anaerobic chamber [manual]

Mikromanipulator do rozdziału tetrad drożdżowych 

Mikromanipulator firmy Singer umożliwia rozdział tetrad drożdżowych i izolację pojedynczych komórek drożdżowych. Tetrady drożdżowe są umieszczane na powierzchni z agaru. Sprzęt wyposażony jest w mikroskop trinokularowy, który zawiera szerokokątny okular o 15-krotnym powiększeniu oraz obiektywy XLWD o 4 i 20-krotnym powiększeniu. Wybrane tetrady można umieścić w zdefiniowanym miejscu, pojedyncze spory można rozdzielić przy użyciu mikromanipulatora, który kontroluje ruch cienkiej szklanej igły.

Wybrane zastosowania:

• analiza sprzężeń genów
• produkcja nowych szczepów drożdżowych zawierających specyficzny zestaw genetyczny
• tworzenie szczepów drożdżowych zawierających mutacje

Micromanipulator for yeast tetrad separation

The Singer yeast tetrad dissection tool is used to tease apart sporulating yeast cells and thus to isolate the individual cells. Tetrads are plated onto an agar surface on a microscopic platform. The microscope workstation includes an integral trinocular microscope, which have 15x widefield eyepieces, 4x and 20x XLWD objectives. The selected tetrads can be replated in a defined position and the individual spores can be separated as desired by using micromanipulator device that controls the movement of the fine glass needle.

Selected applications:

• study of genetic linkages
• production of new yeast strains with unique genetic combination
• engineering mutations into a yeast strain

Monolith NT.115 

Monolith NT.115 wykorzystuje technologię termoforezy mikroskalowej (MST) do pomiaru oddziaływania pomiędzy fluorescencyjnie wyznakowaną próbką a ligandem. Termoforeza (ruch cząsteczek w gradiencie temperatury) zależy od właściwości molekularnych cząsteczki (tj. wielkości, ładunku, otoczki hydratacyjnej czy konformacji), które ulegają zmianie pod wpływem oddziaływania z ligandem. Oddziaływanie jest mierzone w roztworze (bez immobilizacji), stosując gradient temperatury w czasie. Oprogramowanie M.O.Control automatycznie wylicza powinowactwo wiązania (K_D) z dopasowanych krzywych na wykresie zależności fluorescencji od stężenia ligandu. Monolith NT.115 pozwala na analizę oddziaływań biomolekularnych w niemalże natywnych warunkach, ponieważ ta technologia nie jest ograniczona wyborem buforu do analizy. Możliwa jest analiza oddziaływań z białkiem zawierającym ogon histydynowy, które jest obecne w nieoczyszczonym lizacie komórkowym lub serum. Analiza z użyciem Monolith jest szybka (trwa 15 minut) i wymaga jedynie niewielkich ilości próbki (4 ul na kapilarę). Wysoka czułość sprzętu sprawia, że możliwe jest badanie wiązania pojedynczych jonów (40 Da) lub związków drobnocząsteczkowych (300 Da). Ponadto, można również badać wiązanie dużych kompleksów takich jak rybosomy (2,5 MDa). Monolith NT.115 Red/Blue ma zdolność wzbudzenia fluorescencji przy długości fali 460-480 nm oraz 600-650 nm, natomiast detekcja fluorescencji może zachodzić przy 510-530 nm oraz 675-690 nm.

Wybrane zastosowania:

- pomiar powinowactwa (K_D, stała dysocjacji) pomiędzy wybranymi cząsteczkami w roztworze w danej temperaturze (22-45⁰C)

- badanie białek błonowych związanych z liposomami lub w roztworze zawierającym detergenty

- badanie reakcji wielokomponentowych, kolejności tworzenia skomplikowanych kompleksów i badanie czynników wpływających na takie struktury

- odróżnienie agregacji i innych artefaktów od tworzenia specyficznych oddziaływań

- badanie stechiometrii i określenie ilości miejsc wiązania danych cząsteczek

Monolith NT.115 [instrukcja]

Monolith NT.115 

The Monolith NT.115 make use of Microscale thermophoresis (MST) technology to measure the strength of the interaction between fluorescently-labeled sample and a ligand. Thermophoresis, the movement of the molecule in the temperature gradient, depends on molecular properties (i.e. size, charge, hydration shell or conformation) that change upon interaction. The interaction is measured in solution (without immobilization), while a temperature gradient is applied over time. M.O.Control software automatically calculates binding affinity (K_D) values from a fitted curve that plots normalized fluorescence against the concentration of ligand. This method has no strict buffer requirements, thus it enables to analyze the interaction in almost native conditions. Furthermore,the analysis of the interaction with His-tagged protein present in cell lysate or serum can be performed. Monolith allows for fast analysis (15 minutes) and low sample consumption (4 ul per capillary). Another key feature is high sensitivity of the instrument, it can measure even the binding of single ions (40 Da) or small molecules (300 Da) to a target as well as the binding of large complexes such as ribosomes (2.5 MDa) The Monolith NT.115 Red/Blue instrument can excite fluorescence with wavelengths 460-480 nm and 600-650 nm and detect the fluorescence between 510-530 nm and 675-690 nm.

Selected applications:

- measure affinities (K_D, dissociation constant) between any molecules directly in bioliquids at selected temperature (22-45⁰C)

- study membrane bound proteins directly in liposomes or in detergent solutions

- study multi component reactions, complex formation, order of assembly and interfering factors

- separate aggregation and other artifacts from true binding events

- study the stoichiometry and determine the number of binding sites of biomolecules

Monolith NT.115 [user manual]

Ultrawirówki

Dostępne rotory:

50,2 TI

SW 60 TI

SW 40 TI

70.1 TI

NVT 90

SW 41 TI

SW28 TI

SW 60 TI

50 TI

60 TI

80TI

TYPE 19

Ultracentrifuges

Available rotors:

50,2 TI

SW 60 TI

SW 40 TI

70.1 TI

NVT 90

SW 41 TI

SW28 TI

SW 60 TI

50 TI

60 TI

80TI

TYPE 19

Spektrofotometr V-650 

Spektrofotometr V-650 firmy JASCO jest dwuwiązkowy z pojedynczym monochromatorem. Pomiar może być wykonany w zakresie długości fali 190 do 900 nm. Wysoka czułość fotopowielacza zapewnia dokładny pomiar próbek w niskim stężeniu. Źródłem światła w zakresie 190 do 350 nm jest lampa deuterowa, a w zakresie 330-900 nm lampa halogenowa.

Spektrofotometr V650 [broszura]
Spektrofotometr V650 [instrukcja]

Spectrophotometer V-650

The JASCO V-650 is a double-beam spectrophotometer with a single monochromator. Wavelength range between 190 to 900 nm can be applied. The high sensitivity of the photomultiplier tube detector provides accurate measurements of samples at low concentration. Light source: deuterium lamp (190 to 350 nm), halogen lamp (330 to 900 nm)

Spectrophotometer V650 [brochure]
Spectrophotometer V650 [user manual]

Biacore T200

Biacore T200 jest sprzętem najnowszej generacji, umożliwiający badanie oddziaływań (od jonów do wirusów) w czasie rzeczywistym, bez konieczności znakowania próbki. Aby badać oddziaływania, ligand jest immobilizowany na powierzchni sensora, następnie analit jest nastrzykiwany w ciągłym przepływie. Technologia oparta jest na zjawisku Powierzchniowego Rezonansu Plazmonowego (ang. Surface Plasmon Resonance, SPR). Zmiana kąta SPR jest wprost proporcjonalna do masy związanego materiału badawczego. Wynik jest przedstawiany w formie sensogramu, czyli wykresu zależności odpowiedzi (RU, arbitralnie przyjęte jednostki odpowiedzi, ang. Response Units) od czasu.

Czas przeprowadzenia standardowej analizy trwa od 2 do 15 min (dotyczy jednego analitu). Wymagana jest jedynie niewielka objętość próbki (2-350 μl), w niskim stężeniu (>10pM). Wysoka czułość sprzętu Biacore T200 pozwala na analizę oddziaływań z małymi cząsteczkami (100 Da). Możliwa jest analiza wrażliwych na wysoką temperaturę próbkę oraz badanie oddziaływań zależnych od temperatury, ponieważ temperatura komory w której przechowywana jest próbka może być niezależnie ustawiona od komory w której zachodzą analizy (zakres temperatury to 4°C to 45°C). Biacore T200 umożliwia jednoczesną analizą trzech zimmobilizowanych ligandów (biorąc pod uwagę, że jeden z czterech kanałów pozostawiony jest jako kanał referencyjny). W przypadku, gdy nie jest znany analit oddziałujący z danym ligandem, możliwe jest odzyskanie próbki analitu w niewielkiej objętości w celu jego identyfikacji np. przez spektrometrię mas.

Ligand może być zimmobilizowany na powierzchni sensora kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Dostępne są następujące sensory:

• sensory CM (opłaszczone karboksymetylowanym dekstranem) - używane do badania oddziaływań w tym małych cząsteczek organicznych, białek czy wirusów; ligand jest kowalencyjnie wiązany do powierzchni sensora przez grupy aminowe, tiolowe aldehydowe lub karboksylowe.
• sensory z zimmobilizowanym Białkiem A, Białkiem G lub Białkiem L- używane do wiązania przeciwciał w specyficznej orientacji
• sensor SA (opłaszczony streptawidyną)- używany do immobilizacji biotynylowanych peptydów, białek lub kwasów nukleinowych
• sensor NTA- używany do immobilizacji molekuł zawierających znacznik histydynowy, powierzchnia może być regenerowana przez nastrzyk EDTA
• sensory HPA i L1- używane do badania oddziaływań związanych z błoną oraz do badania białek transbłonowych

Wybrane zastosowania:

• weryfikacja oddziaływań pomiędzy dwoma bądź więcej molekułami
• określanie stężenia badanych aktywnych cząsteczek (zakres stężeń: 1 pM do 2 mM)
• wyznaczanie stałych powinowactwa (asocjacji K_A i dysocjacji K_D ) (zakres fM do mM)
• wyznaczanie stałych szybkości reakcji (k_on i k_off)

Więcej informacji o zasadzie działania SPR:
https://www.youtube.com/watch?v=o8d46ueAwXI

Biacore T200 [instrukcja]
Biacore- projektowanie doświadczeń [instrukcja]

Biacore T200

Biacore T200 is the state-of-the-art equipment that allows for a label-free analysis of interactions ranging from ions to viruses in real-time. To study the interaction between two binding partners, one of the molecule (ligand) is immoblilized on a sensor chip, while the interaction partner (analyte) is passed over the sensor chip surface in the continuous flow of sample solution. The technology is based on the phenomenon of Surface Plasmon Resonance (SPR).  The change in SPR angle is proportional to the mass of material bound. The result is displayed as a sensorgram, a plot of response (RU, arbitrary Response Units) against time.

The analysis is fast and takes typically 2 to 15 min per one analyte for standard applications. It uses low volumes of samples (2-350 μl) and allows for the analysis of samples at low concentration (>10pM). The high sensitivity of Biacore T200 allows for binding analysis of as small molecules as 100 Da. The temperature in the sample compartment can be set separately from the temperature during the analysis (temperature range: 4°C to 45°C). Thus, unstable samples can be stored in low temperature prior to analysis and the temperature-dependent interactions can be tested.  Biacore T200 supports simultaneous analysis of three immobilized ligands (considering one out of four flow cell as a reference). If an analyte that binds to the sensor surface during sample injection is unknow, it can be recovered in a small volume to analyze it by e.g. mass spectrometry. Therefore, Biacore T200 is suitable for the discovery of novel interactions.

The ligand can be attached to the sensor chip covalently or non-covalently. Following sensor chips are available:

• sensor chips CM (coated with carboxymethylated dextran) - used to study interactions involving small organic molecules, proteins or viruses; the ligand is covalently attached to the surface via amine, thiol, aldehyde or carboxyl groups  
• sensor chips with an immobilized Protein A or Protein G or Protein L- used for orientation-specific binding of antibodies
• sensor chip SA (Streptavidin coated) - used for immobilization of biotinylated peptides, proteins or nucleic acids
• sensor chip NTA- used for histidine-tagged molecules immobilization, the surface can be regenerated by EDTA injection
• sensor chips HPA and L1- used to study membrane-associated interactions and transmembrane proteins

Selected applications:

• verification of the interaction between two molecules or complexes
• determination of the concentration of an actve molecule (concentration range 1 pM to 2 mM)
• determination of affinity association constant K_A, dissociation constant K_D (affinity range fM to mM)
• determination of association k_on and dissociation k_off rate constants

See more information on the principle of SPR:
https://www.youtube.com/watch?v=o8d46ueAwXI

Biacore T200 [user manual]
Biacore Assay Handbook [user manual]

Mikroskop Sił Atomowych BioScope Resolve z głowicą skanującą MultiMode8 Lockout Specs

Posiadany mikroskop to unikalny układ AFM umożliwiający obserwację dynamiki izolowanych systemów biochemicznych, całych komórek oraz złożonych układów biologicznych. Mikroskop ten pozwala na wysokorozdzielcze (rozdzielczość liczona w nanometrach) obrazowanie zarówno bardzo małych molekuł, jak również dużych komórek eukariotycznych. Możliwość uzyskiwania obrazów wysokiej rozdzielczości w krótkim czasie pozwala na śledzenie dynamiki procesów zachodzących w badanych układach. Pozwala na prowadzenie obserwacji preparatów utrwalonych jak i cząsteczek w roztworach wodnych. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym  (single-molecule-real-time-kinetics) jest aktualnie najnowocześniejszym podejściem badawczym stosowanym w badaniach biochemicznych.
BioScope Resolve AFM [broszura]
Obrazowanie podwójnej helisy DNA przy użyciu AFM [pdf]

Atomic Force Microscope Bioscope Resolve with MultiMode8 Lockout Specs 

Our microscope is a unique AFM system that allows observation of the dynamics of isolated biochemical systems, whole cells and complex biological systems. This microscope allows high-resolution scanning (resolution calculated in nanometers) of very small molecules, as well as large eukaryotic cells. The possibility to obtain high-resolution images in a short time, allows to investigate the dynamics of the processes of the studied systems. It allows to observe both fixed preparation and molecules in aqueous solutions. Images are obtained in real time for individual molecules (single-molecule-real-time-kinetics), which is currently one of the most technologically advanced research approach used in biochemistry.
BioScope Resolve AFM [brochure]
Imaging of the DNA Double Helix by AFM [pdf]

Spektrofotometr dichroizmu kołowego Jasco J-1500 

Aparat CD JASCO J-1500 pracuje w szerokim zakresie długości fali od 165 do 900 nm, posiada źródło światła w postaci lampy Xe o mocy 150 W, która jest chłodzona powietrzem oraz monochromator podwójny pryzmatyczny. Zastosowany w aparacie detektor to fotopowielacz. Na aparacie JASCO J-1500 możliwe jest równoczesne skanowanie CD i LD w funkcji długości fali, w funkcji czasu oraz w funkcji temperatury. Temperatura pomiaru jest kontrolowana za pomocą modułu Peltiera chłodzonego wodą (-30 do +120°C). Aparat jest przystosowany do kuwet prostokątnych o drodze optycznej: 10mm, 5mm, 2mm, 1mm. Oprogramowanie sterujące spektrometrem oraz oprzyrządowaniem pozwala m.in. na równoczesne zbieranie sygnałów co najmniej z 4 kanałów, wyświetlanie i nakładanie widm, obróbkę widm z wykorzystaniem funkcji matematycznych, liczenie pochodnych, szacowanie struktury drugorzędowej białek, analizę denaturacji białek.

Circular Dichroism Spectrophotometer Jasco J-1500 [instrukcja]

Circular Dichroism Spectrophotometer Jasco J-1500

CD JASCO J-1500 works at wide spectra range of 165-900nm, it has air-cooled 150W Xe lamp source and double monochromator. Te detector used in the device is a photomultiplier. JASCO J-1500 allows for simuntaneous scanning of CD and LD as a function of wavelength, time and temperature. The analysis temperature is controlled by Peltier module (-30 to 130°C). Rectangular cuvettes of optical path length 10mm, 5mm, 2mm, 1mm can be used. The software that controls the device allows for i.a. parallel acquisition of up to four data channels, presentation and superposition of spectra, spectra analysis with the use of mathematical functions, calculating derivatives, protein secondary structure estimation, protein denaturation analysis.     

Circular Dichroism Spectrophotometer Jasco J-1500 [user manual]